NobleRyder 染料法qPCRMix
NobleRyder 染料法qPCRMixNobleRyder FQ-PCR05-1 染料法qPCRMix 2× Universal SYBR qPCR Master Mix 1mLNobleRyder FQ-PCR05-5 染料法qPCRMix 2× Universal SYBR qPCR Master Mix 5mL
NobleRyder FQ-PCR05-1 染料法qPCRMix 2× Universal SYBR qPCR Master Mix 1mL
產(chǎn)品品牌：NobleRyder
產(chǎn)品貨號：FQ-PCR05-1
產(chǎn)品名稱：染料法qPCRMix
英文名稱：2× Universal SYBR qPCR Master Mix
產(chǎn)品規(guī)格：1mL
NobleRyder 染料法qPCRMix
產(chǎn)品內(nèi)容：
組分 | FQ-PCR05-1 | FQ-PCR05-5 |
2× Universal SYBR qPCR Master Mix | 1 mL | 4×1.25 mL |
DNase-free Water | 1 mL | 4×1.25 mL |
產(chǎn)品簡介
2× Universal SYBR qPCR Master Mix是使用SYBR Green I 嵌合熒光法進行qPCR的2×試劑加強宣傳。主要成分包括化學修飾的Hot Start Fast Taq DNA Polymerase重要的作用、dNTP鍛造、Mg2+形式、SYBR Green I和針對qPCR優(yōu)化的最適Buffer長足發展。本產(chǎn)品可在寬廣的定量區(qū)域內(nèi)獲得良好的標準曲線服務為一體，實驗結(jié)果重復性好問題、可信度高逐漸顯現。另外，預混液體系中添加了特殊ROX Reference Dye系統穩定性，適用于不同qPCR 儀器拓展基地，配置反應體系時只需加入引物和模板即可擴增。
注意事項
1. 為了您的安全和健康實力增強，請穿實驗服并戴一次性手套操作分享。
2. 請于使用前確保產(chǎn)品wan全解凍，徹di混勻后短暫離心信息化，置于冰上備用方式之一。
3. 反復凍融會影響產(chǎn)品性能。如每次用量較少新型儲能，推薦小份分裝使用創新能力。
4. 本產(chǎn)品中含熒光染料SYBR Green I，使用中應盡量避免強光照射範圍。
實驗流程
配制檢測試劑
1. 按照下表配置PCR反應體系（注：配置多個反應孔時求得平衡，請為各組分預留10%的余量，以免移液損失空間廣闊。）
試劑組份 | 20μL體系 | 50μL體系 |
2× Universal SYBR qPCR Master Mix | 10 μL | 25μL |
Forward Primer (10μM) | 0.4 μL* | 1μL* |
Reverse Primer (10μM) | 0.4 μL* | 1μL* |
模板DNA/cDNA | X μL* | X μL* |
DNase-free Water | As required | As required |
Total Volume | Up to 20 μL | Up to 50 μL |
*通常每條引物終濃度為0.2 μM至關重要，也可根據(jù)情況在0.1~0.4μM 間進行調(diào)整。
*微量體積加樣時誤差大服務品質，建議模板稀釋后再加入反應體系中的發生，這樣可以有效提高實驗的重復性；如模板類型為未稀釋cDNA原液表現明顯更佳，使用體積不應超過qPCR反應總體積的 1/10狀態。
2. 反應體系配好后技術節能，蓋好反應蓋指導，充分渦旋混勻，離心國際要求，避免產(chǎn)生氣泡流動性。
反應程序設(shè)置
標準程序
Stage | 步驟 | 溫度 | 時間 | 循環(huán)數(shù) |
Stage 1 | 預變性/酶激活* | 95 ℃ | 5 min | 1 |
Stage 2 | 變性 | 95 ℃ | 15 sec | 40 |
退火/延伸/采集信號* | 60 ℃ | 40 sec* | ||
Stage 3 | 熔解曲線* | 儀器默認程序 | 1 | |
快速程序
Stage 1 | 步驟 | 溫度 | 時間 | 循環(huán)數(shù) |
Stage 1 | 預變性/酶激活* | 95 ℃ | 5 min | 1 |
Stage 2 | 變性 | 95 ℃ | 2 sec | 40 |
退火/延伸/采集信號* | 60 ℃ | 20 sec* | ||
Stage 3 | 熔解曲線* | 儀器默認程序 | 1 | |
*延伸時間請根據(jù)您使用的Real Time qPCR儀數(shù)據(jù)采集最短時間限制以及PCR產(chǎn)物長度自行調(diào)整。
*模板拷貝數(shù)較低時采用標準程序可提高數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性競爭激烈。
結(jié)果分析
定量檢測至少需要三個生物學重復持續創新，反應結(jié)束后需要確認擴增曲線的線形，熔解曲線的峰形空白區。
1. 擴增曲線：標準擴增曲線為S型協調機製。
Ct值小于10，需要將模板稀釋后形勢，重新進行實驗（每稀釋一倍實踐者，Ct值增大1）取得明顯成效；
Ct值30-35之間時，需要提高模板濃度貢獻力量，或者增大反應體系的體積使用，以提高擴增效率，保證結(jié)果分析的準確性發行速度；
Ct值大于35時更加堅強，檢測結(jié)果不可信。
2. 熔解曲線：
熔解曲線單峰性能，表明反應特異性好可以進行定量結(jié)果分析初步建立；若熔解曲線出現(xiàn)明顯雙峰或者多峰，則不能進行定量分析供給，需要重新設(shè)計引物各有優勢。
常見問題與解決方案
?擴增曲線形狀異常
①擴增曲線不光滑：使用的八聯(lián)排管或PCR板可能與設(shè)備不匹配，設(shè)備光源可能松動重要的意義。
②擴增曲線突然驟降：反應管內(nèi)留有氣泡持續，樣本離心后仔細檢查反應管內(nèi)是否有氣泡殘留。
?反應結(jié)束無擴增曲線出現(xiàn)
①循環(huán)數(shù)不夠：一般設(shè)置為40個循環(huán)再獲。
②確認程序中是否設(shè)置了信號采集步驟產品和服務。
③確認引物、模板是否降解體驗區。
?陰性對照出現(xiàn)擴增
①反應體系污染：更換新的Mix增多、水、引物重復實驗有望。在超凈工作臺進行反應體系配置進一步推進，減少氣溶膠污染。
②產(chǎn)生引物二聚體方案，配合溶解曲線進行分析應用的選擇。
③使用含UDG/dUTP 防污染體系的擴增試劑。
?實驗重復性差
①加樣體積失準：建議使用大體積加樣以減少誤差左右。
②模板濃度太低：模板濃度越低背景下，重復性越差，減少模板稀釋倍數(shù)或增加模板體積可靠保障。
③反應體系未充分混勻：上機檢測前將反應體系充分混勻后再離心自然條件。
產(chǎn)品訂購信息：
NobleRyder FQ-PCR05-1 染料法qPCRMix 2× Universal SYBR qPCR Master Mix 1mL
NobleRyder FQ-PCR05-5 染料法qPCRMix 2× Universal SYBR qPCR Master Mix 5mL
NobleRyder FQ-PCR06-1 染料法qPCRMix 2× miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix 1mL
NobleRyder FQ-PCR06-5 染料法qPCRMix 2× miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix 5mL
NobleRyder FQ-PCR07-1 染料法qPCRMix 2x Blue Universal SYBR qPCR Master Mix 1mL
NobleRyder FQ-PCR07-5 染料法qPCRMix 2× Blue Universal SYBR qPCR Master Mix 5mL
NobleRyder 染料法qPCRMix
