M-MuLV Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄試劑
本制品使用通過基因重組技術(shù)克隆表達(dá)的點突變型RNase H活性缺失的M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶Script Hˉ Rtase重要工具， 同時經(jīng)過多點突變影響，獲得的能高達(dá)60℃的第四代反轉(zhuǎn)錄酶（Script IV M-MuLV）可持續，在50-60℃均有較好的反轉(zhuǎn)錄效果了解情況，同時大大的提高了GC含量高具有重要意義，二級結(jié)構(gòu)豐富的RNA模板的反轉(zhuǎn)錄效率技術先進。M-MuLV Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄試劑
Script IV M-MuLV Reverse Transcriptase
M-MuLV Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄試劑
目錄號：71413
產(chǎn)品內(nèi)容
Components | 71413-10000 | 71413-50000 |
IV M-MuLV (200U/ μl) | 10000 U | 50000 U |
5x RT Buffer | 250 μl | 5x 500 μl |
保存條件：-20℃保存更多的合作機會，有效期 12 個月。
產(chǎn)品簡介
本制品使用通過基因重組技術(shù)克隆表達(dá)的點突變型RNase H活性缺失的M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶Script Hˉ Rtase認為， 同時經(jīng)過多點突變服務好，獲得的能高達(dá)60℃的第四代反轉(zhuǎn)錄酶（Script IV M-MuLV），在50-60℃均有較好的反轉(zhuǎn)錄效果反應能力，同時大大的提高了GC含量高共謀發展，二級結(jié)構(gòu)豐富的RNA模板的反轉(zhuǎn)錄效率。野生型的M-MuLV 包含的RNase H活性能夠催化降解DNA/RNA雜合體中的RNA結構重塑，因此在cDNA第一條鏈的合成反應(yīng)中可能會降解RNA/DNA雜合體中的模板RNA聽得懂。Script IV M-MuLV (RNase Hˉ)的RNase H活性缺失，與MMuLV 相比高質量發展，具有更強(qiáng)的延伸能力和穩(wěn)定性全方位，可用于較長的cDNA合成以及高比例的全長cDNA文庫的構(gòu)建等。
適用范圍
第一鏈cDNA合成影響力範圍〈缶?？捎糜诘涂截惢虻臋z測新創新即將到來。
產(chǎn)品特點
合成cDNA片段長度最高可達(dá)15 kb。
引物的選擇：
1. 如果RNA模板來源于真核生物shou選Oligo (dT)有序推進，與真核生物mRNA的3’PolyA尾配對設施，可獲得最高產(chǎn)量的全長cDNA。
2. 如果對一些物種堅定不移，不能確定mRNA是否有polyA尾的情況下組合運用，shou選Oligo(dT)，不成功再嘗試基因特異性引物(GSP)和Random primer為引物迎難而上。
3. 基因特異性引物(GSP)的特異性較高積極。但有些情況下，用于PCR反應(yīng)的GSP無法有效引導(dǎo)第一鏈cDNA合成進一步完善，可改用Oligo (dT)或Randomprimer重新進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄集聚。
4. Random primer特異性zui低，所有RNA調整推進，包括mRNA狀況，rRNA，tRNA均可以作為Random primer的模板不斷創新。當(dāng)目標(biāo)區(qū)域具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)或GC含量較高建立和完善，或者模板為原核生物來源，使用Oligo (dT)或基因特異性引物(GSP)無法有效引導(dǎo)cDNA合成時參與水平，可使用Random primer為引物大型。
5. 如果合成cDNA下游用于qPCR，可將Oligo (dT)與Random primer混合使用（各加1μl /20μl反應(yīng)體系）明確相關要求，可使mRNA的各個區(qū)域cDNA合成效率相同重要意義，有助于提高qPCR結(jié)果的真實性和重復(fù)性。
第一連 cDNA 合成 (以 20 μl 反應(yīng)體系為例)
1．反應(yīng)體系的配制
操作前深化涉外，請將各組分輕彈混勻體系，點甩離心收集至管底，置冰上備用開展試點。
使用 RNase-Free PCR 管在冰上配制：
Components | Volume |
Total RNA | 50 ng - 5 μg |
Oligo(dT)18 (0.5 μg /μl) or Random primer (N6) (0.1 μg/μl) or GSP (Gene Specific Primer , 2 pmol/μl) or | 1 μl |
1 μl | |
1 μl | |
5x RT Buffer | 4 μl |
RNase Inhibitor (40 units/μl) | 0.5 μl |
IV M-MuLV (200U/μl) | 1 μl |
RNase free H2O | To 20 μl |
2．輕柔吸打混勻攜手共進，點甩離心，置 PCR 儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)推進一步。
如用Oligo(dT)18或基因特異性引物(GSP)經過，產(chǎn)物用于PCR：50℃孵育30 min；
產(chǎn)物用于qPCR：50℃孵育15 min力度。
如用 Random Primer,25℃孵育10 min 后明確了方向，產(chǎn)物用于 PCR，50℃孵育30 min勇探新路；
25℃孵育 10 min 后增產，產(chǎn)物用于 qPCR便利性，50℃孵育 15 min。
注意：如果模板具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)或高 GC 區(qū)域行動力，可以先只加 RNA 模板、引物和 RNase free H2O切實把製度，混勻保供，65℃變性 5 min，冰上冷卻進行部署，點甩離心后加入其它成分責任，并將 50℃孵育溫度提升至 55°C，有助于提高產(chǎn)量保護好。
3． 85°C加熱 5 sec組建，失活RTase和dsDNase，終止反應(yīng)運行好。
逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可立即用于PCR或qPCR反應(yīng)首次，或保存于-20°C，并在半年內(nèi)使用部署安排；長期存放建議分裝后在-70°C保存搖籃，cDNA應(yīng)避免反復(fù)凍融。
PCR
建議取2 - 4 μl的cDNA產(chǎn)物原液作為PCR模板推廣開來。
1. 常規(guī)擴(kuò)增：71019-2x Taq PCR MasterMix (30sec/kb)
71800-2x Lightning Taq PCR MasterMix (10sec/kb)
2. 高保真擴(kuò)增：71812-2x FastHiFi PCR MasterMix (≤3kb片段)
71814-2×LongHiFi PCR MasterMix (≤10kb片段)
qPCR
建議取1~2μl cDNA產(chǎn)物原液作為20μl qPCR反應(yīng)體系的模板推動。如果基因表
達(dá)量較高，請根據(jù)實際情況適當(dāng)稀釋cDNA模板后使用資源配置。
相關(guān)產(chǎn)品：
71519 2x SYBR Green qPCR Mix (同TB Green Premix Ex Taq)
71600 2x Universal SYBR Green qPCR Mix (適用于所有qPCR儀)
91011 RNAzol Reagent（Trizol）
91013 通用型總RNA快速提取試劑盒（動物信息、植物、細(xì)菌大力發展、真菌豐富內涵、酵母）
91218 動物組織/細(xì)胞/昆蟲總RNA提取試劑盒 (同RNeasy Plus Mini Kit)
91318 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（RNeasy Plant Mini Kit的升級版)
91451 高效動物組織/細(xì)胞總RNA提取試劑盒 (動物組織、細(xì)胞)
91452 高效植物總RNA提取試劑盒（根不同需求、莖發展、葉、花）
M-MuLV Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄試劑
