IIImiRNA First Stand Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄
Script III miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（by stem-loop）采用第三代高效逆轉(zhuǎn)錄酶支撐作用，具有更強(qiáng)的延伸能力和穩(wěn)定性服務體系，并配備了具有DNA分解活性的特殊dsDNase去創新，只需一步操作調解製度， 即可同時(shí)完成基因組清除與莖環(huán)法miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)發展的關鍵，操作方便快捷系列。IIImiRNA First Stand Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄
Script III miRNA1st Strand cDNA Synthesis Kit（by stem-loop）莖環(huán)法 miRNA 第一連反轉(zhuǎn)錄試劑盒 打印
IIImiRNA First Stand Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄
目錄號:71505
產(chǎn)品內(nèi)容
Components | 71505-50 50 rxns (20 μl/rxn) | 71505-100 100 rxns (20 μl/rxn) |
5x miRT Reaction Mix | 200 μl | 400 μl |
dsDNase | 50 μl | 100 μl |
RNase free H2O | 1.5 ml | 1.5 ml |
保存條件
-20℃保存作用，有效期 12 個月。
產(chǎn)品簡介
Script III miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（by stem-loop）采用第三代高效逆轉(zhuǎn)錄酶慢體驗，具有更強(qiáng)的延伸能力和穩(wěn)定性著力增加，并配備了具有DNA分解活性的特殊dsDNase，只需一步操作科技實力， 即可同時(shí)完成基因組清除與莖環(huán)法miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)處理，操作方便快捷。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以用于后續(xù)的染料法或探針法熒光定量檢測在此基礎上。此方法特異性高只對成熟的miRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)助力各行，不受其前體干擾，序列高度同源的miRNA也可精確區(qū)分自主研發。本試劑盒具有可從20 pg ~ 2 μg的total RNA中高效制備miRNA對應(yīng)的第一鏈cDNA確定性。
原理：本試劑盒采用莖環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄引物與 miRNA 分子的3’端 結(jié)合，并在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下進(jìn)行反應(yīng)損耗，獲得人為加長的 miRNA 第一鏈 cDNA講故事。
引物的制備：
需要自己設(shè)計(jì)、合成用于反轉(zhuǎn)錄的頸環(huán)引物性能穩定！
microRNA莖環(huán)引物及Realtime-PCR引物設(shè)計(jì)方法如下：
1. stem-loop RT引物設(shè)計(jì)：
基于通用的莖環(huán)結(jié)構(gòu)全面革新，只需要按照不同的miRNA序列修改最末端6個堿基即可。通用莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列為：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC。
例如設(shè)計(jì)miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU）的RT引物線上線下，只需在通用莖環(huán)序列后加上miRNA3’末端的6個堿基的反向互補(bǔ)序列發揮重要作用，即GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCA CTGGATACGACATACAT。
2. realtime 上游引物設(shè)計(jì)：
miRNA序列除去3’端6個堿基 的剩余部分作為上游引物講道理，如miR-1的上游引物為(注意 把U改為T)：TGGAATGTAAAGAAGT.檢查引物的Tm 值（一般參考DNAMAN）發展目標奮鬥，如果Tm值較低，則在5’端加GC使Tm值接近60度更多的合作機會。因此miR-1的上游引物可設(shè)計(jì) 為：GCGCTGGAATGTAAAGAAGT延伸，61.4度。
下游引物是通用的服務好，序列為GTGCAGGGTCCGAGGT新趨勢。
引物設(shè)計(jì)好后，需要通過預(yù)試驗(yàn)檢測引物的特異性共謀發展。一般需要做溶解曲線來檢測引物的特異性學習；同時(shí)最好將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測產(chǎn)物是否單一（產(chǎn)物長度很短，需要3%以上的瓊脂糖膠）
操作步驟： (以20 μl反應(yīng)體系為例)
1．莖環(huán)法反轉(zhuǎn)錄體系的配制
使用 RNase-Free PCR 管在冰上配制：(使用前聽得懂，請將各組分輕彈混勻應用優勢，點(diǎn)甩離心收集至管底，置冰上備用全方位。)
Components | Volume |
Total RNA / miRNA | 20 ng - 2 μg / 5 ng -200 ng |
Stem-loop Primer(0.1 μg/μl) | 1 μl |
5x miRT Reaction Mix | 3.6 ~ 4 μl (注意事項(xiàng) 1) |
dsDNase | 1 μl |
RNase free H2O | To 20 μl |
2．輕柔吸打混勻高效節能，點(diǎn)甩離心，置 PCR 儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)大局。
25℃孵育 5 min 后新創新即將到來， 42℃孵育 20 min，85°C 加熱 5 sec有序推進，失活 RTase 和 dsDNase設施，終止反應(yīng)。
3．合成的cDNA反應(yīng)液可放置于-20℃保存道路，也可以直接進(jìn)行下游PCR或者熒光定量qPCR檢測規模設備。
注意事項(xiàng)：
1. 在反應(yīng)中使用的total RNA 必須含有小分子RNA 真諦所在。
2. 此過程也可以使用小分子RNA指導， miRNA無法直接用分光光度計(jì)定量，建議加入量為2μl ~5μl充分∵M一步完善？筛鶕?jù)目的miRNA豐度決定加入量，但是對于低豐度miRNA 樣品而言(如血清血漿提取物)競爭力，可直接加入最大體積8 μl調整推進。
3. 5 × miRT Reaction Mix非常粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸頭外導(dǎo)致?lián)p失，用前請點(diǎn)甩離心后使用不斷創新，并且避免吸頭外壁沾附損失建立和完善。可以每次按照3.6-3.8μl使用，也不影響使用效果參與水平。
按照miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒(貨號P501)進(jìn)行qPCR大型。
注：按照上述操作步驟得到的cDNA模板用于下游PCR或者熒光定量PCR檢測時(shí)，可以根據(jù)實(shí)際情況選擇使用量明確相關要求，對于特殊的檢測體系中重要意義，高含量的cDNA模板易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，可根據(jù)所檢測miRNA的豐度適當(dāng)?shù)南♂?/span>cDNA（5-10倍或者100倍）后使用深化涉外。如果發(fā)現(xiàn)有非特異擴(kuò)增條帶體系，或者融鏈曲線顯示有非特異擴(kuò)增，往往提示cDNA模板過量開展試點，可以嘗試將上述cDNA模板稀釋幾十到幾百倍甚至上千倍再使用攜手共進。
IIImiRNA First Stand Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄
