TOPO-TA/Blunt Lightning Cloning Kit-
可在室溫條件下紮實做，20分鐘完成TA克隆或Blunt克隆記得牢，陽性率接近100%研究，并且免冰浴交流研討、免熱激改進措施、免藍(lán)白斑篩選的可能性，還可以連接長達(dá)10kb的DNA片段不要畏懼。TOPO-TA/Blunt Lightning Cloning Kit-
TOPO-TA/Blunt Lightning Cloning Kit（含酶切位點）
TOPO-TA/Blunt Lightning Cloning Kit-
目錄號：42211
產(chǎn)品內(nèi)容：
產(chǎn)品成份 | 42211-20 (20 rxn) | 42211-80（80 rxn） |
pTOPO-TA/Blunt Vector (30ng/ul) | 40 ul | 160 ul |
1000bp Control (30ng/ul) | 5 ul | 5 ul |
10x Enhancer | 20 ul | 20 ul |
保存條件：
-20℃，存放 12 個月問題，不影響使用效果逐漸顯現。
產(chǎn)品簡介：
可在室溫條件下，20分鐘完成TA克隆或Blunt克隆系統穩定性，陽性率接近100%拓展基地，并且免冰浴、免熱激實力增強、免藍(lán)白斑篩選體系流動性，還可以連接長達(dá)10kb的DNA片段探索創新。
克隆步驟（≤3kb 片段）： 簡化步驟（≤10kb 片段）-- 免復(fù)蘇，免液體 LB
1實現了超越、連接：室溫 5 分鐘新產品； 1、連接: 37℃連接 5 min橋梁作用。
2長遠所需、轉(zhuǎn)化：室溫 5 分鐘； 2讓人糾結、轉(zhuǎn)化：冰浴 5 min生產創效，42℃熱激 1 min，冰上 2 min管理。
3、復(fù)蘇：180rpm能力建設、37℃振蕩培養(yǎng) 10 分鐘模樣；涂板。 3服務、取全部菌液涂板很重要，37℃倒置培養(yǎng)。
操作步驟：
1. PCR 產(chǎn)物的制備：
a. 引物要求：引物不能磷酸化指導。
b. 酶的選擇：根據(jù)需要選擇DNA 聚合酶廣泛認同，該載體兼容PCR 產(chǎn)物的A 末端和平末端。
c. 電泳檢測 PCR 產(chǎn)物的量和質(zhì)量：
①僅有目的條帶流動性，可直接進(jìn)行連接反應(yīng)鍛造，無需純化；
②如果有多條帶持續創新，建議凝膠回收 DNA 片段（DC011-100）;
③如果以質(zhì)粒為模板的擴增改善，則必須進(jìn)行凝膠回收，因為模板質(zhì)粒也會長出非目的菌落協調機製。
2. 連接反應(yīng)：
1） 室溫（20℃-37℃）建立連接體系（10ul 體系）：
純化后的 PCR 產(chǎn)物 | 0.5-5 ul |
pTOPO-TA/blunt Vector | 2 ul |
10 ? Enhancer | 1 ul |
滅菌水 | X ul |
總體積 | 10 ul |
不同大小插入片段的推薦用量：
插入片段大行畔⒒?。╞p） | 最佳用量（ng） |
100-1000 | 10-40 |
1000-2000 | 40-80 |
2000-5000 | 80-180 |
加完試劑后，輕彈管底混勻（或輕輕吹打混勻）實踐者，點甩離心收集所有液體在離心管底取得明顯成效。
2) 室溫（20℃-37℃）連接 5 分鐘。連接產(chǎn)物可直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞數據，或置于冰上備用創新的技術。
3. 轉(zhuǎn)化、復(fù)蘇改進措施、涂板：
1）100ul 感受態(tài)細(xì)胞就此掀開，置于室溫解凍（約 1 分鐘左右）長足發展，輕撣幾次將細(xì)胞均勻懸浮。
2） 加入 10ul 連接液穩步前行，輕輕混勻結構不合理，室溫（20℃-37℃）放置 5 分鐘。
3） 加入 500ul 平衡至室溫的 LB 或者 SOC 培養(yǎng)基(不含抗生素)逐步改善，37℃ 180 rpm 振蕩培養(yǎng) 10 min意見征詢。
（注意：大于 3kb 的片段，振蕩培養(yǎng)時間延長至 30-60 分鐘大大提高，可以增加轉(zhuǎn)化子的必然要求。或者用簡化步驟）
4） 取 200?l 菌液涂板(含氨芐青霉su 50-100ug/ml）取得了一定進展，培養(yǎng)過夜完善好。（為得到較多克隆，4000 rpm 離心 1 min積極參與，吸棄掉部分上清活動上，保留 100-150ul，輕彈懸浮菌體進一步推進，取全部菌液涂板）
注意：如果使用 5ul 體系導向作用，各成分按照比例減半，使用次數(shù)可以加倍應用的選擇。
4. 轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定：
本制品陽性率相當(dāng)高十大行動，一般情況下，可以達(dá)到所見即所得背景下，只要是長出來的菌落正常（不是污染的雜菌綜合措施，轉(zhuǎn)化子數(shù)量也不算太少），基本就包含插入等特點。因此插入片段不超過 2-3kb 的情況下可以不用鑒定直接挑 1-2 個菌去測序建言直達。
1） 菌落 PCR 檢測：挑單菌落于 10ul 無菌水中，混勻將進一步，取 1ul 置于 25ul PCR 體系,用 PCR 引物或者M(jìn)13 通用引物去鑒定陽性克隆充分發揮。
2）用通用 M13F（-20）/M13R（-26）引物測序來確定是否含有目的克隆。
TOPO-TA/Blunt Lightning Cloning Kit-
