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One Step Gibson Cloning Kit 無縫克隆

• 型   號：42112
• 價   格：
• 更新時間：2025-04-23
• 廠家性質(zhì)：經(jīng)銷商

本制品不依賴于T4連接酶，不受載體和目的片段的酶切位點限制發展需要，而直接用重疊片段重組的方法組建，采用特殊的酶組合可以將任意方法線性化后的載體和與其兩端具有15-25bp重疊區(qū)域的PCR片段（平端）定向重組組成部分，可以快速實現(xiàn)1-5個片段的高效無縫克隆可靠保障。
One Step Gibson Cloning Kit 無縫克隆

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One Step Gibson Cloning Kit

(可連接1-5個片段)

One Step Gibson Cloning Kit 無縫克隆

 目錄號：42112

包 裝 量：

產(chǎn)品儲存：-20°C保存，避免反復凍融

制品說明：本制品不依賴于T4連接酶現場，不受載體和目的片段的酶切位點限制高端化，而直接用重疊片段重組的方法，采用特殊的酶組合可以將任意方法線性化后的載體和與其兩端具有15-25bp重疊區(qū)域的PCR片段（平端）定向重組我有所應，可以快速實現(xiàn)1-5個片段的高效無縫克隆提單產。

產(chǎn)品特點：

1. 30分鐘可以將一個或者多個長、短PCR擴增片段（平端）插入載體至關重要。

2. 不受載體和插入片段酶切位點的可用性和載體平端/粘性末端的限制發展空間，可以在任意位點進行克隆。

3. 無縫克隆有所應，插入點不會引入不需要的堿基序列足了準備。

4. 高效、準確著力提升，陽性率＞95% 深刻內涵。

線性化載體和插入DNA片段的制備：

A：線性化載體的制備

 (1). 酶切來源：酶切所得線性載體，平末端或者粘端融合、單酶切或者雙酶切均可深入闡釋，酶切后膠回收。

注： 無縫拼接和克隆反應體系內(nèi)無雙鏈DNA連接酶完成的事情，不會發(fā)生載體自連反應物聯與互聯。因此，即使是以單酶切方式制備的線性化載體也無需進行末端脫磷酸處理改造層面。重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后出現(xiàn)的假陽性克隆 (無插入片段) 是由酶切不wan全未線性化環(huán)狀載體轉(zhuǎn)化而形成的供給。我們推薦酶切后膠回收可以把這種未線性化載體比例降低到zui低程度。

(2). 反向PCR來源：建議使用高保真DNA聚合酶（貨號：P517-05）制備經驗分享，如果擴增條帶單一可以通過PCR產(chǎn)物純化（貨號：DC012-100）獲得載體投入力度，否則通過膠回收（貨號：DC011-100)獲得載體。

注：反向PCR的質(zhì)粒模板也是非線性化載體不難發現，也可能導致假陽性克仑暙I法治。o插入片段）設備製造，因此PCR來源線性載體（PCR產(chǎn)物）純化前用Dpn I內(nèi)切酶消化質(zhì)粒模板，可以降低背景攻堅克難，提高陽性率管理。但是一般情況下，經(jīng)過膠回收已經(jīng)足以把這種未線性化載體比例降低到zui低流程，因此反向PCR來源的線性化載體我們也推薦膠回收合作。

B：插入DNA片段的制備

(1). 單個插入片段克隆引物設計：克隆引物包括插入片段特異性引物序列和重疊序列。

克隆正向引物(5’-3’)：線性載體正向16-25 nt重疊區(qū)序列(3’末端算起)+插入片段正向特異引物序列（18-25 nt）

克隆反向引物(5’-3’)：線性載體反向16-25 nt重疊區(qū)序列(3’末端算起)+插入片段反向特異引物序列（18-25 nt）

注意：重疊區(qū)的堿基數(shù)至少16 bp助力各業，并且多段重疊區(qū)域之間的Tm值需保持一致且﹥60°C (AT pair = 2°C and GC pair = 4°C)極致用戶體驗，否則可延長堿基數(shù)目直到符合要求。

按照線性載體末端的結構（5’突出應用，3’突出建議，平末端），引物設計也分3種情況.

線性化載體的兩端因線性方式（如單酶切相貫通、雙酶切不斷發展、反向PCR）不同，可以是以上三種末端結構的兩兩任意組合自動化方案，插入片段特異性引物設計的原則遵循一般引物設計的原則即可緊密協作。

計算擴增引物退火溫度時，只需計算基因特異性擴增序列的Tm值線上線下，載體末端同源序列不應參與計算發揮重要作用。

根據(jù)上述設計原則，從3’端開始計算數據顯示，往回算16bp-25bp（本舉例采用了20 bp末端重疊相同序列）去突破，加到目的片段特異引物序列前面即可。確保重疊區(qū)域的Tm值保持一致且﹥60°C (AT pair = 2°C and GC pair = 4°C)達到。

正向引物具體如下：5' — GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

注意：以上引物設計完成克隆連接后智能設備，EcoR I 酶切位點將會消失（不保留酶切位點）。

如果需要保留 EcoR I 酶切位點蓬勃發展，需要在載體末端20 bp重疊序列和目的片段特異引物序列之間補齊缺失的EcoR I 識別位點序列aattc特點，完成克隆連接后，EcoR I 酶切位點依然存在（保留酶切位點）重要性。

具體如下：5' — GAGCCTAGGTGAGTTGGCCG aattc NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

載體由Hind III 酶切開又進了一步，形成5’突出末端：

根據(jù)上述設計原則，從3’端開始計算多元化服務體系，往回算16bp-25bp（本舉例采用了20 bp末端重疊相同序列）規劃，加到目的片段特異引物序列前面即可集中展示。確保重疊區(qū)域的Tm值保持一致且﹥60°C (AT pair = 2°C and GC pair = 4°C)重要組成部分。

反向引物具體如下：5' — CTGCCATCGGATCGTTCGCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

注意：以上引物設計完成克隆連接后現場，Hind III 切位點將會消失（不保留酶切位點）協同控製。

如果需要保留 Hind III 酶切位點，需要在載體末端20 bp重疊序列和目的片段特異引物序列之間補齊缺失的Hind III 識別位點序列agctt 核心技術，Hind III 酶切位點依然存在（保留酶切位點）應用提升。

具體如下：5' — CTGCCATCGGATCGTTCGCA agctt NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

 (2). 多個插入片段的克隆引物設計：與載體兩端連接的插入片段引物設計方法同單片段設計方法

* 多個插入片段之間重疊區(qū)設計有上述*標記(藍色和紅色）的兩種方式，在多片段引物設計時創造性，選擇任意一種方式或者兩種方式混用均可發展的關鍵，保證片段與片段之間有15-25bp 的重疊區(qū)。

(3). 酶的選擇：建議使用高保真DNA聚合酶或者PCR Mix（貨號：P517-05或者P814-05）規模設備。

(4). 反應條件：一般按照具體使用的聚合酶說明書進行即可真諦所在。

(5). 純化插入片段

l可選：如果片段來源于質(zhì)粒模板，且該質(zhì)粒與重組載體具有相同抗性競爭力，純化前用Dpn I內(nèi)切酶消化質(zhì)粒模板充分， 可降低背景，提高陽性率製造業。

l如果片段單一，則建議用PCR產(chǎn)物純化試劑盒（貨號：43012-100）純化片段關規定。

l 如果有非特異擴增發展基礎，則建議用膠回收試劑盒（貨號：43011-100）回收片段。

l 使用該方法克隆建強保護，用來線性化載體的酶切位點在拼接的時候會缺失同期，如果對酶切位點有嚴格要求的，建議 注意酶切位點的選擇使命責任，必要時可在正反向克隆引物的重疊區(qū)序列和特異基因序列之間增加缺失掉的堿基來恢復原有酶切位點（見前述正反向引物設計舉例說明）效果。

l 如果重組質(zhì)粒用于蛋白表達，則在引物設計時注意讀碼框合規意識，蛋白表達及純化所需序列（如啟動子密度增加，RBS序列，起始密碼子創新內容，終止密碼子機遇與挑戰，蛋白標簽等）不被破壞。

無縫克隆反應的操作步驟：

注意：2 × Cloning Master Mix 含有連接增強劑PEG很粘稠善於監督，從冰箱拿出來溫度低時更粘稠集成技術，可以放在手心化凍幾分鐘提高溫度便可降低粘稠度（不影響質(zhì)量），手指bo打離心管底充分混勻或者渦旋震蕩混勻更合理。

1. 按照下表建立反應體系（可使用PCR管在室溫配制）

* 載體一般用10-50 ng適應能力，插入片段與載體的摩爾比在2:1-3:1之間最佳；如果插入片段小于200bp實際需求，插入片段與載體的摩爾比用5:1解決方案，多片段連接的情況下優勢，片段與片段之間摩爾比為1:1。

2. 輕輕混勻幅度，在50°C反應15分鐘（可在PCR儀器上進行）結構，反應結束后，將PCR管置冰上后直接轉(zhuǎn)化或者保存于-20°C貢獻。超過3個片段的連接規模最大，可以延長反應時間到30分鐘。

3. 取5 μl 反應產(chǎn)物按照感受態(tài)細胞說明書進行轉(zhuǎn)化（如果轉(zhuǎn)化子較少統籌，可以將所有的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化并將所有的轉(zhuǎn)化液涂板）最深厚的底氣。

陽性克隆的鑒定：

可根據(jù)具體情況，選擇菌落PCR鑒定振奮起來，提取質(zhì)粒（貨號31011-100）進行限制性內(nèi)切酶鑒定或測序鑒定品質。

One Step Gibson Cloning Kit 無縫克隆