One Step Seamless Cloning Kit 無縫克隆
一步法無縫克隆試劑盒不依賴于T4連接酶就能壓製，不受載體和目的片段的酶切位點限制相互配合，而直接用重疊片段重組的方法創造，采用特殊的酶組合可以將任意方法線性化后的載體和與其兩端具有16-25bp重疊區(qū)域的PCR片段定向重組連接積極性，可以30分鐘內實現(xiàn)A末端或者平末端PCR產(chǎn)物片段高效定向無縫克隆至載體的任意位點至關重要。One Step Seamless Cloning Kit 無縫克隆
One Step Seamless Cloning Kit (單片段)
One Step Seamless Cloning Kit 無縫克隆
目錄號：42111
包 裝 量：
Components | 42111-20（20次） | 42111-50（50次） |
2 × One Step Cloning Mix | 50μl × 2 | 250μl |
產(chǎn)品儲存：-20°C保存十大行動，避免多次反復凍融
制品說明：一步法無縫克隆試劑盒不依賴于T4連接酶左右，不受載體和目的片段的酶切位點限制，而直接用重疊片段重組的方法綜合措施，采用特殊的酶組合可以將任意方法線性化后的載體和與其兩端具有16-25bp重疊區(qū)域的PCR片段定向重組連接可靠保障，可以30分鐘內實現(xiàn)A末端或者平末端PCR產(chǎn)物片段高效定向無縫克隆至載體的任意位點。
產(chǎn)品特點：
1. 30分鐘可以將一個50bp-15kb PCR擴增片段（平/A末端）克隆插入任意載體的任意位置設計標準。
2.不受載體和插入片段酶切位點的可用性和平端/粘性末端的限制開展，可以在任意位點進行克隆。
3. 無縫克隆充分發揮，插入點不會引入不需要的堿基序列發展成就。
4. 不依賴于連接酶及磷酸酶，高效重要方式，準確開展面對面，克隆陽性率可達95%以上。
一步法無縫克隆試劑盒原理示意圖：
線性化載體和插入DNA片段的制備：
A：線性化載體的制備
(1). 酶切來源：酶切所得線性載體，平末端或者粘端連日來、單酶切或者雙酶切均可快速融入，酶切后膠回收。
注： 一步法無縫克隆反應體系內無雙鏈DNA連接酶系統，不會發(fā)生載體自連反應增強。因此，即使是以單酶切方式制備的線性化載體也無需進行末端脫磷酸處理交流等。重組產(chǎn)物轉化后出現(xiàn)的假陽性克隆 (無插入片段) 是由酶切不wa全未線性化環(huán)狀載體轉化而形成的更加廣闊。我們推薦酶切后膠回收可以把這種未線性化載體比例降低到zui低程度。
(2). 反向PCR來源：建議使用高保真DNA聚合酶制備提高，如果擴增條帶單一可以通過PCR產(chǎn)物純化（貨號：DC012-50）獲得載體可以使用，否則通過膠回收（貨號：DC011-50)獲得載體。
注：反向PCR的質粒模板也是非線性化載體紮實，也可能導致假陽性克滦Ц呋?。o插入片段），因此PCR來源線性載體（PCR產(chǎn)物）純化前用Dpn I內切酶消化質粒模板投入力度，可以降低背景創造，提高陽性率。但是一般情況下貢獻法治，經(jīng)過膠回收已經(jīng)足以把這種未線性化載體比例降低到zui低設備製造，因此反向PCR來源的線性化載體我們也推薦膠回收。
B：插入DNA片段的制備
(1). 一步法無縫克隆引物設計總的原則是：通過在引物5’ 端引入線性化克隆載體末端同源序列共享，使得插入片段擴增產(chǎn)物5’和3’最末端分別帶有和線性化克隆載體兩末端對應的wan全一致的序列 (16 bp～20 bp)信息化。
(2). 插入片段引物設計：克隆引物包括插入片段特異性引物序列和重疊序列。
克隆正向引物(5’-3’)：線性載體正向16-25 nt重疊區(qū)序列(3’末端算起)+插入片段正向特異引物序列（18-25 nt）
克隆反向引物(5’-3’)：線性載體反向16-25 nt重疊區(qū)序列(3’末端算起)+插入片段反向特異引物序列（18-25 nt）
注意：重疊區(qū)的堿基數(shù)至少16 bp生動，并且多段重疊區(qū)域之間的Tm值需保持一致且﹥60°C (AT pair = 2°C and GC pair = 4°C)新型儲能，否則可延長堿基數(shù)目直到符合要求。
按照線性載體末端的結構（5’突出新品技，3’突出範圍，平末端），引物設計也分3種情況紮實做，示意如下：
線性化載體的兩端因線性方式（如單酶切空間廣闊、雙酶切、反向PCR）不同提供深度撮合服務，可以是以上三種末端結構的兩兩任意組合服務品質，插入片段特異性引物設計的原則遵循一般引物設計的原則即可。
計算擴增引物退火溫度時集聚效應，只需計算基因特異性擴增序列的Tm值集成，載體末端同源序列不應參與計算重要手段。
(3). 酶的選擇：建議使用高保真DNA聚合酶或者PCR Mix（貨號：P517-05或者P814-05）。
(4). 反應條件：一般按照具體使用的聚合酶說明書進行即可穩定性。
(5). 純化插入片段
l 可選：如果片段來源于質粒模板像一棵樹，且該質粒與重組載體具有相同抗性，純化前用Dpn I內切酶消化質粒模板去突破， 可降低背景能運用，提高陽性率。
l 如果片段單一智能設備，則建議用PCR產(chǎn)物純化試劑盒（貨號：DC012-100）純化片段不可缺少。
l 如果有非特異擴增，則建議用膠回收試劑盒（貨號：DC011-100)回收片段喜愛。
l 使用該方法克隆重要的角色，用來線性化載體的酶切位點在拼接的時候會缺失，如果對酶切位點有嚴格要求的向好態勢，建議注意酶切位點的選擇，必要時可在正反向克隆引物的重疊區(qū)序列和特異基因序列之間增加缺失掉的堿基來恢復原有酶切位點（見后面舉例說明）服務機製。
l 如果重組質粒用于蛋白表達貢獻力量，則在引物設計時注意讀碼框，蛋白表達及純化所需序列（如啟動子大幅拓展，RBS序列發行速度，起始密碼子，終止密碼子與時俱進，蛋白標簽等）不被破壞性能。
正向引物設計舉例說明（EcoR I 酶切開）：
如上圖，載體由Ecor I 酶切開綜合運用，形成5’突出末端：
根據(jù)上述設計原則供給，從3’端開始計算，往回算16bp-25bp（本舉例采用了20 bp末端重疊相同序列）實事求是，加到目的片段特異引物序列前面即可進行探討。確保重疊區(qū)域的Tm值保持一致且﹥60°C (AT pair = 2°C and GC pair = 4°C)。
正向引物具體如下：5' — GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'
注意：以上引物設計完成克隆連接后服務水平，EcoR I 酶切位點將會消失（不保留酶切位點）最新。
如果需要保留 EcoR I 酶切位點，需要在載體末端20 bp重疊序列和目的片段特異引物序列之間補齊缺失的EcoR I 識別位點序列aattc規則製定，完成克隆連接后製造業，EcoR I 酶切位點依然存在（保留酶切位點）。
具體如下：5' — GAGCCTAGGTGAGTTGGCCG aattc NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'
反向引物設計舉例說明（Hind III 酶切開）：
如上圖關規定，載體由Hind III 酶切開發展基礎，形成5’突出末端：
根據(jù)上述設計原則兩個角度入手，從3’端開始計算，往回算16bp-25bp（本舉例采用了20 bp末端重疊相同序列）顯示，加到目的片段特異引物序列前面即可創新為先。確保重疊區(qū)域的Tm值保持一致且﹥60°C (AT pair = 2°C and GC pair = 4°C)。
反向引物具體如下：5' — CTGCCATCGGATCGTTCGCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'
注意：以上引物設計完成克隆連接后科普活動，Hind III 切位點將會消失（不保留酶切位點）創新延展。
如果需要保留 Hind III 酶切位點，需要在載體末端20 bp重疊序列和目的片段特異引物序列之間補齊缺失的Hind III 識別位點序列agctt 長期間，Hind III 酶切位點依然存在（保留酶切位點）基本情況。
具體如下：5' — CTGCCATCGGATCGTTCGCA agctt NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'
無縫克隆反應的操作步驟：
注意：2 × OneStep Cloning Mix 含有連接增強劑PEG很粘稠，從冰箱拿出來溫度低時更粘稠高端化，可以放在手心化凍幾分鐘提高溫度便可降低粘稠度（不影響質量）力量，輕彈混勻，瞬間離心收集到管底提單產。
1. 按照下表建立反應體系（可使用PCR管在室溫配制）
2 × One Step Cloning Mix | 5 μl |
Linear Vector (10-80 ng) | X μl* |
Insert | Y μl* |
dd H2O | To 10 μl |
* 載體一般用20-50 ng深入實施，插入片段與載體的摩爾比在2:1-3:1之間最佳；如果插入片段小于200bp發展空間，插入片段與載體的摩爾比用5:1 效果。
2. 輕輕混勻，在50°C反應15分鐘（可在PCR儀器上進行）足了準備，反應結束后合作關系，將PCR管置冰上后直接轉化或者保存于-20°C。較短片段例如100bp-1kb只需要15分鐘便能獲得足夠轉化子深刻內涵，較長片段的連接傳遞，可以延長反應時間到60分鐘。
3. 取5μl 反應產(chǎn)物按照感受態(tài)細胞說明書進行轉化（如果轉化子較少深入闡釋，可以將所有的產(chǎn)物轉化并將所有的轉化液涂板）相關性。
陽性克隆的鑒定：
可根據(jù)具體情況，選擇菌落PCR鑒定提高，提取質粒（貨號31013-100）進行限制性內切酶鑒定或測序鑒定成效與經驗。
One Step Seamless Cloning Kit 無縫克隆
